免疫荧光染色（Immunofluorescence，IF）基于抗原-抗体特异性结合，利用荧光素标记抗体，通过荧光显微镜观察目标蛋白在细胞或组织中的定位与表达，主要包括直接法和间接法。

在免疫荧光实验中，串色是影响实验结果准确性的重要因素之一，下面是一些有效避免串色的建议。 

1、细胞铺板与选择：控制细胞密度 

细胞铺得过密会导致一抗结合位点过多，从而增加非特异性染色的风险。细胞密度过高还会导致拍摄效果不佳。例如，对于6孔板中满孔的细胞，建议取1/8的量铺到带有爬片的12孔板中，经过大约12小时培养后，细胞密度会达到较为理想的状态。 

选择大体积细胞（如HeLa细胞）进行实验，可以提高拍摄效果。相比之下，HEK细胞的效果可能稍差。如果使用非工具细胞，则无需考虑细胞体积对拍摄效果的影响。 

2、染色顺序：核染色的时机 

在双抗体染色实验中，建议将核染色放在最后一步进行。避免在实验开始时使用活细胞染核液（如Hoechst），而是在封片时使用DAPI进行核染色。同时，注意控制DAPI的浓度，因为细胞核很容易被染色，低浓度即可达到良好的效果。 

3、细胞状态：细胞状态与支原体污染

使用状态良好且未被污染的细胞进行免疫荧光实验至关重要状态良好的细胞通常伸展良好，染色效果也更佳。如果细胞受到支原体污染，可能会出现严重的非特异性染色，且难以去除甚至会导致核染色和抗体染色出现异常。因此，在进行免疫荧光实验之前，务必进行支原体清除，确保细胞状态良好。

4、一抗使用：一抗浓度与选择 

①外源蛋白染色：如果实验涉及外源蛋白（如转染质粒后的蛋白表达），建议使用标签抗体进行染色。标签抗体通常具有更高的特异性，且使用浓度较低，一般在1:500左右。 

②内源性蛋白染色：对于内源性蛋白的染色，一抗浓度可适当提高至1:200左右。在使用前，务必仔细查抗体说明书，确认该抗体是否适用于免疫荧光实验。 

③一抗孵育条件：4℃过夜孵育效果更好，可以提高抗体与抗原的结合效率。一抗可以回收，并在-20℃保存，通常可重复使用3次左右，具体使用次数取决于抗体的灵敏度。 

④抗体组合：在双抗体免疫荧光实验中，建议选择不同宿主来源的抗体，例如一个使用小鼠抗体，另一个使用免抗体，避免使用双小鼠或双兔抗体，以减少交叉反应。 

5、二抗使用：二抗孵育与洗涤 

二抗的孵育时间通常为1~2小时，需在常温下进行，并注意避光操作。在选择二抗时，要避免与一抗具有相同属性的二抗以减少串色的可能性。在洗涤过程中，一抗可用PBS洗涤，而二抗则建议使用TBST（TBS+0.05%Tween-20），适当增加吐温的浓度可以提高洗涤效果。

6、拍摄参数：拍摄时的激发光选择 

在封片后拍摄时，适当调整激发光波长可以有效避免串色。建议选择没有交叉波长的激发光，例如绿光488nm和红光555nm是较好的选择。

文章出自：验外实包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/